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      EN
      DNA Standards有擴增,而文庫沒有或Ct很大

      1、文庫接頭序列錯誤。核對文庫末端序列與試劑盒提供的引物序列是否匹配。 2、稀釋度過高。減少稀釋倍數,重復實驗。 3、文庫降解。文庫應現用現稀釋,稀釋好的文庫應置于冰上備用,用完丟棄。

      稀釋文庫Ct超過標準曲線有效Ct范圍

      1、Ct (稀釋文庫) < Ct (DNA Standard 1),提示文庫稀釋度不夠,多見于過度擴增的文庫。提高文庫稀釋倍數重復實驗。 2、Ct (稀釋文庫) > Ct (DNA Standard 6),提示文庫稀釋度過高或構建失敗。常規文庫在1/10,000左右的稀釋度時得到的Ct不應超過Ct (DNA Standard 6)。減少稀釋倍數重復實驗。

      文庫各稀釋度計算的初始文庫濃度差異超過10%

      1、移液精確度差。 2、所有試劑在使用前應充分解凍并徹底混勻。 3、文庫難于擴增。GC/AT含量過高或長度超過1 kb的文庫擴增效率較差,定量波動性大。 4、文庫降解。文庫應現用現稀釋,稀釋好的文庫應置于冰上備用,用完丟棄。

      文庫各稀釋度ΔCt與稀釋倍數差異不一致

      1、移液精確度差。 2、所有試劑在使用前應充分解凍并徹底混勻。 3、文庫難于擴增。GC/AT含量過高或長度超過1 kb的文庫擴增效率較差,定量波動性大。 4、文庫降解。文庫應現用現稀釋,稀釋好的文庫應置于冰上備用,用完丟棄。

      復孔重復性差

      1、移液精確度差。 2、所有試劑在使用前應充分解凍并徹底混勻。 3、儀器相關問題。確認所用ROX Reference Dye與定量儀器匹配。

      標曲擴增曲線分布不均一

      1、Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,提示反應體系有污染。應根據NTC陰性對照的融解曲線確認污染源(文庫污染或DNA Standards污染) 。 2、Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1,提示基線(Baseline)設置不當。手動調整基線(Baseline)為1-3。 3、DNA Standards之間的ΔCt > 3.6,提示擴增效率差。確認所有試劑在使用前都已充分解凍并徹底混勻;確認所有組分濃度正確以及反應程序無誤;確認每三個復孔的數據Ct≤0.2,否則去掉。 4、長時間強光照射會導致2×SYBR qPCR Master Mix熒光值下降,進而造成ΔCt > 3.6。應按照推薦方式避光貯存試劑。

      R2 < 0.99

      1、受污染影響的標準品的Ct值未舍棄。 2、所有試劑在使用前應充分解凍并徹底混勻。 3、儀器相關問題。確認所用ROX Reference Dye與定量儀器匹配。 4、移液精確度差。

      擴增效率偏出90%-110%范圍

      1、如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,且計算擴增效率超過100%,提示反應體系有污染。應根據NTC陰性對照的融解曲線確認污染源(文庫污染或DNA Standards污染)。繪制標準曲線時,應先根據Ct (NTC)確定標準曲線有效Ct值范圍,舍棄受污染影響的Ct,使用剩余的Ct 繪制。 2、不恰當的基線(Baseline)設置會增大Ct (DNA Standard 1),進而影響擴增效率計算。手動調整基線(Baseline)為1-3循環。 3、移液精確度差。

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